Duidelijker kon de ommekeer in de machtsverhoudingen niet tot uiting komen: op het wapen van Overijssel uit 1528 prijkt prominent de Hollandse leeuw, met de golvende IJssel op de achtergrond. Op de eerste lentedag van dat jaar huldigden Ridderschap en Steden van Overijssel hun nieuwe landsheer Karel V (1500-1558), die als graaf van Holland bij monde van zijn stadhouder Jurjen Schenck van Toutenburg (1480-1540) het gezag over het gewest aanvaardde. Na meer dan vijf eeuwen kwam er een einde aan het bestuur van de bisschop van Utrecht. Overijssel maakte niet langer deel uit van het Oversticht, maar gold nu als afgebakende staatkundige eenheid. Het jaar 1528 geldt daarmee als geboortejaar van de provincie Overijssel. Het provinciale wapen is als kleurrijke geboorteakte tot op heden in gebruik.
Gelderse Oorlogen
Het gezag van de bisschop-vorsten van Utrecht was al decennialang tanende. De Stichtse gebieden raakten steeds nauwer betrokken bij de machtsstrijd tussen de Habsburgse Nederlanden en het hertogdom Gelre. Hertog Karel van Gelre (1467-1538) koos in zijn verzet tegen de annexatiepolitiek van de machtige Habsburgse vorsten voor de aanval. Hij kon hierbij rekenen op steun van de Franse koning. Door de noordelijke gewesten van de Nederlanden in te palmen hoopte hij zijn zelfstandigheid te kunnen waarborgen. In 1508 nam hij het bisschoppelijke slot Kuinre aan de grens met Friesland in. Dat was het begin van twee decennia strijd op Overijsselse bodem. Gelderse troepen veroverden en plunderden grote delen van Overijssel. Met veel moeite en hoge kosten wisten de inwoners onder leiding van bisschop Frederik van Baden de vijand te verdrijven. De Gelderse Oorlogen zadelden Overijssel op met hoge schulden en belastingen, terwijl de handel stagneerde. In 1517 vielen tot overmaat van ramp Duitse schuldeisers met 1200 ruiters en meer dan 3000 man voetvolk Twente binnen om hun gram te halen. De verarmde bevolking was ten einde raad. Veel hulp van de Habsburgse Nederlanden had Overijssel niet te verwachten. In Holland was men allang blij dat de bom niet op eigen bodem was gebarsten.
Ontknoping
Te midden van deze misère kwam Zwolle in conflict met Kampen; deze laatste was tol gaan heffen aan de monding van het Zwartewater. De twist leidde in 1520 tot een oorlog tussen beide steden met wederzijdse gewelddadigheden, brandstichtingen, gijzelingen en berovingen. Het weifelende optreden van bisschop Filips van Bourgondië (1464-1524) en een omstreden interventie van Karel V, die als kersverse keizer van het Duitse Rijk zeggenschap over tolkwesties meende te hebben, was voor de Zwollenaren aanleiding om een verbond met Karel van Gelre te sluiten en hem als landsheer te aanvaarden. Dit verraad van de Zwolse "blauwvingers" (meineedplegers) leidde tot een nieuwe golf van geweld in heel Overijssel. Maar de positie van de hertog van Gelre verzwakte door het wegvallen van zijn Franse bondgenoot en militaire tegenslagen. De Zwollenaren keerden op hun schreden terug en ontzegden de troepen van Karel van Gelre de toegang tot hun stad. De getergde hertog nam enkele jaren later wraak met een nieuw grootschalig offensief in Overijssel. De machteloze Utrechtse bisschop Hendrik van Beieren vroeg Karel V om hulp. De vorst stelde als voorwaarde dat hij het wereldlijk gezag over het Neder- en Oversticht zou verkrijgen. Met de nodige tegenzin gingen Ridderschap en Steden van Overijssel akkoord met deze machtsoverdracht. Binnen enkele maanden na de inhuldiging verdreef stadhouder Jurjen Schenck van Toutenburg de Gelderse troepen voorgoed uit Overijssel. Gelre zelf zou in 1543 als laatste van de Nederlandse gewesten in handen van Karel V vallen.
Naar zelfstandigheid
Het Habsburgse gezag betekende een versterking van de gewestelijke eenheid van Overijssel, maar een verzwakking van de oude rechten van de ridderschap en de afzonderlijke steden. Karel V zegde weliswaar toe alle rechten van zijn nieuwe onderdanen te handhaven, maar in de praktijk deden zich al gauw spanningen voor. De bisschop van Utrecht was voor zijn gezagsuitoefening in militair en financieel opzicht afhankelijk geweest van zijn onderdanen. Ridderschap en Steden van Overijssel hadden deze positie weten te benutten om tal van rechten en privileges te verwerven. Karel V echter was als Duitse keizer, koning van Spanje en heer der Nederlanden oppermachtig en op geen enkele manier van het marginale Overijssel afhankelijk. Vanuit het bestuurscentrum Brussel probeerden hij en zijn opvolger Filips II vernieuwingen op juridisch en bestuurlijk vlak door te voeren, die meer eenheid in de territoriale Nederlandse lappendeken teweeg moesten brengen. Dit zou leiden tot een nieuw conflict over de oude privileges, een nationale opstand zelfs, waardoor het jonge Overijssel noodgedwongen al snel op eigen benen kwam te staan.